Hướng dẫn thiết lập môi trường nuôi cấy mô dừa hiệu quả

Phương pháp nuôi cấy mô là hướng nhân giống dừa hiện đại được ứng dụng với nhu cầu tạo ra những cây con với chất lượng cao và số lượng ổn định nhằm phục vụ cho nhu cầu sản xuất quy mô lớn. Đối với toàn bộ quy trình, môi trường nuôi cấy giữ vai trò trung tâm vì đây là yếu tố quyết định đến khả năng sống, phát triển và biệt hóa của mẫu mô trong điều kiện nhân tạo.

Một môi trường được thiết lập hợp lý sẽ giúp các mẫu mô có thể phát triển hài hòa và có khả năng thích ứng linh hoạt với sự chuyển đổi giữa các giai đoạn nuôi cấy thông qua việc điều chỉnh mức độ phù hợp về dinh dưỡng, hormone và điều kiện nuôi, từ đó đảm bảo quá trình tái sinh cây diễn ra ổn định và hiệu quả. Ở bài viết này, ViGen sẽ cùng các bạn đọc tìm hiểu về môi trường nuôi cấy mô dừa thích hợp qua từng giai đoạn phát triển của cây.

Môi trường nuôi cấy mô dừa theo từng giai đoạn sinh trưởng

Giai đoạn khởi tạo mô sẹo

Trong quy trình nuôi cấy mô dừa thì giai đoạn khởi tạo mô sẹo là bước nền tảng quan trọng quyết định đến khả năng thành công của toàn bộ chuỗi nhân giống vô tính sau đó. Ở giai đoạn này, mục tiêu chính của chúng ta là kích thích các tế bào trong mẫu cấy, ở đây thường là phôi non, mô phôi hoặc phần mầm chồi để bắt đầu quá trình kích thích phân chia mạnh mẽ nhằm giúp mẫu chuyển hóa từ trạng thái biệt hóa sang chưa biệt hóa để hình thành mô sẹo.

Với những đặc điểm nói trên, môi trường nuôi cấy mô dừa phổ biến nhất trong giai đoạn này là môi trường dinh dưỡng Y3 được thiết kế riêng cho dừa với thành phần khoáng tối ưu hơn so với môi trường MS. Y3 có tỷ lệ K⁺/NH₄⁺ cao hơn, giúp hạn chế độc tính ammonium đối với mô dừa, đồng thời cũng giàu nồng độ Ca²⁺ và Mg²⁺ với vai trò quan trọng giúp đảm bảo ổn định màng tế bào và giảm quá trình oxy hóa phenolic.

Nền muối này giúp tế bào dừa non vốn rất nhạy cảm với thay đổi pH và ion có thể phát triển bền vững trong môi trường nhân tạo. Kế đến, nguồn carbon chính trong môi trường nuôi cấy mô dừa ở đây là Succrose với lượng chúng ta sẽ sử dụng là 30 g/L, với vai trò cung cấp năng lượng cho sự phát triển và điều chỉnh áp suất thẩm thấu của mẫu mô.

Ở nồng độ này, môi trường nuôi cấy mô dừa Succrose không chỉ là nguồn năng lượng mà còn đóng vai trò điều hòa hoạt động sinh lý, giúp mô sẹo phát triển ổn định và không bị chai cứng. Bên cạnh đó, việc bổ sung Casein Hydrolysate trong môi trường nuôi cấy mô dừa cung cấp các amino acid dễ hấp thu, giúp tăng tốc độ phân chia tế bào và cải thiện màu sắc mô sẹo, đồng thời giảm stress sinh lý trong giai đoạn đầu của mẫu.

Đối với các chất điều hòa sinh trưởng, ở giai đoạn này thì thành phần chủ lực là Auxin 2,4-D, là một loại Auxin tổng hợp có tác dụng mạnh trong kích thích phân chia tế bào. Việc áp dụng một nồng độ đủ cao để kích thích sự mất cân bằng của hormone nội sinh nhằm tạo ra điều kiện để buộc mô chuyển sang trạng thái phân sinh trong môi trường nuôi cấy mô dừa.

Nhờ 2,4-D, các tế bào trưởng thành trong phôi bắt đầu quá trình phân chia không định hướng để tạo ra mô sẹo vô tổ chức, đây sẽ là tiền đề cho phôi soma hình thành ở giai đoạn sau. Tuy nhiên, nếu sử dụng nồng độ quá cao thì mô dễ bị hóa nâu hoặc chết sinh lý.

Một yếu tố sinh học quan trọng khác trong môi trường nuôi cấy mô dừa là nước dừa non, vốn chứa nhiều những Cytokinin tự nhiên, Gibberellin và các Vitamin nhóm B, từ đó giúp mô có thể duy trì hoạt tính trao đổi chất cao cũng như làm mềm cấu trúc tế bào và giảm mức độ stress mẫu do những kỹ thuật viên thao tác xử lý.

Cùng với đó thì than hoạt tính cũng được thêm vào trong môi trường nuôi cấy mô dừa nhằm hấp phụ các hợp chất phenolic tiết ra trong quá trình nuôi để ngăn ngừa hiện tượng mô bị hóa nâu. Đây vốn là vấn đề phổ biến nhất xảy ra trong quá trình làm việc với nhiều những mẫu mô, trong đó có cả mẫu dừa. Ngoài ra thì than hoạt tính cũng hấp thụ bớt lượng 2,4-D dư để giúp môi trường ổn định và mô phát triển đồng đều hơn.

Giai đoạn cảm ứng phôi Soma

Sau khi mô sẹo được hình thành ổn định, bước tiếp theo trong quy trình nuôi cấy mô dừa là giai đoạn cảm ứng phôi Soma. Giai đoạn này là giai đoạn chuyển đổi từ các cụm tế bào chưa biệt hóa thành những cấu trúc có tổ chức cao hơn, mang đặc điểm của phôi thật sự. Đây là giai đoạn bản lề, nơi mô sẹo sẽ làm quen dần với cách tái thiết lập trục phát triển để mở đầu cho quá trình tái sinh thành cây non hoàn chỉnh.

Vậy nên môi trường nuôi cấy mô dừa ở đây chúng ta sẽ sử dụng môi trường Y3 hoặc MS biến đổi, tùy loại vật liệu ban đầu và phản ứng của mô sẹo. Khi so với Y3 thuần thì môi trường MS cung cấp hàm lượng Nitơ cao hơn, giúp kích thích hoạt động của enzyme trong tế bào, từ đó thúc đẩy quá trình biệt hóa. Tuy nhiên, để tránh độc tính thì chúng ta thường chỉ dùng MS khi mô đã ổn định hoặc chỉ sử dụng khi mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần từ môi trường Y3.

Tại giai đoạn này thì nguồn Carbon được cung cấp cho môi trường nuôi cấy mô dừa sẽ tăng lên 40 g/L Succrose, cao hơn so với giai đoạn trước. Mục đích ở đây là để cung cấp năng lượng cho sự tổng hợp các chất dự trữ như protein, tinh bột và lipid trong quá trình hình thành phôi sơ cấp. Ngoài ra thì nồng độ đường cao còn giúp tạo ra áp suất thẩm thấu thuận lợi để tế bào có thể bắt đầu phân cực và hình thành lớp vỏ ngoài của phôi Soma.

Về sự thay đổi trong nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cần thiết, môi trường nuôi cấy mô dừa ở giai đoạn này có xu hướng cân bằng giữa Auxin và Cytokinin với nồng độ Auxin 2,4-D được hạ thấp xuống ở mức vừa đủ để mẫu có thể duy trì hoạt động phân chia nhưng không gây ra sự ức chế biệt hóa. Bên cạnh đó thì sự gia giảm của Auxin còn giúp tế bào chuyển hướng sinh lý để không còn nhân đôi ngẫu nhiên mà có thể bắt đầu tổ chức thành mô định hình.

Cùng lúc đó, môi trường nuôi cấy mô dừa được bổ sung thêm BAP — một loại Cytokinin giúp kích thích sự biểu hiện gen liên quan đến phát sinh cơ quan và cấu trúc phôi, đóng vai trò tín hiệu cho tế bào bắt đầu sự phân hóa trục mầm và rễ, đánh dấu cho sự chuyển hóa từ mô sẹo sang phôi Soma thật sự.

Cũng giống như giai đoạn trên, nước dừa non tiếp tục giữ vai trò điều hòa nội môi trong môi trường nuôi cấy mô dừa, giúp mô phát triển khỏe hơn và giảm tỷ lệ thoái hóa phôi. Tương tự, than hoạt tính vẫn được duy trì để hấp phụ các chất phenolic và phần hormone dư thừa để đảm bảo môi trường sinh trưởng được thông thoáng và ổn định, nhưng so với giai đoạn 1 thì liều lượng than hoạt tính cần điều chỉnh xuống thấp hơn để không cản trở tác dụng của Cytokinin trong quá trình hình thành phôi.

Giai đoạn trưởng thành phôi

Sau khi các phôi soma sơ cấp đã được hình thành và nhận diện rõ về hình thái, chúng ta sẽ tiến đến giai đoạn tiếp theo là giai đoạn trưởng thành phôi, nơi các phôi chuyển từ trạng thái sinh lý non sang giai đoạn phát triển hoàn thiện về cấu trúc và chức năng. Môi trường nuôi cấy mô dừa được sử dụng trong giai đoạn này vẫn dựa trên nền Y3 nhưng có sự điều chỉnh sâu về thành phần hormone và các tác nhân thẩm thấu.

So với hai giai đoạn trước, môi trường nuôi cấy mô dừa trong giai đoạn này gần như loại bỏ hoàn toàn sự hiện diện của Auxin và Cytokinin, vì hai loại chất điều hòa sinh trưởng này nếu tồn tại sẽ cản trở quá trình chín của phôi và dẫn đến hiện tượng phôi non lâu hoặc phôi dị dạng. Thay vào đó thì ABA sẽ là hormone sinh trưởng chủ đạo trong môi trường nuôi cấy mô dừa giai đoạn trưởng thành.

Nó đóng vai trò như một tín hiệu sinh lý báo lại cho tế bào để ngừng quá phân chia nhanh và bắt đầu tích lũy những loại vật chất dự trữ như protein, tinh bột, và lipid. Với nồng độ vừa đủ thì ABA giúp phôi hình thành lớp vỏ cutin hóa nhẹ, nhờ đó gia tăng khả năng chống mất nước và cố định dần cấu trúc tế bào. Chính nhờ ABA, mẫu phôi Soma trong môi trường nuôi cấy mô dừa có thể mô phỏng được quá trình trưởng thành tự nhiên diễn ra trong chính hạt dừa thật.

Cùng với đó, PEG 6000 sẽ được bổ sung nhằm tạo áp suất thẩm thấu cao, từ đó gây ra hiện tượng hạn nhân tạo. Hiện tượng này tạo ra áp lực khiến cho tế bào phôi suy giảm hoạt động sinh trưởng nhanh mà thay vào đó là chuyển dần sang trạng thái tích lũy.

Hơn nữa, PEG còn giúp ổn định lượng nước trong mô nhằm giúp phôi có bề mặt săn chắc, ít bị phù, đồng thời kích thích biểu hiện các gen liên quan đến khả năng sinh tồn và sống sót khi được chuyển sang môi trường nuôi cấy mô dừa khác. Vì thế, cặp đôi ABA – PEG chính là nhân tố trung tâm cho sự trưởng thành của phôi dừa trong giai đoạn này.

Tới giai đoạn này thì nguồn Carbon trong môi trường nuôi cấy mô dừa cũng được giảm lại về mức 30 g/L Succrose nhằm tránh dư năng lượng gây nảy mầm sớm. Nồng độ này ở mức vừa đủ để cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp vật chất dự trữ của mẫu nhưng không quá nhiều không kích thích phân chia tế bào. Cuối cùng, than hoạt tính trong thời điểm này vẫn tiếp tục được giữ lại để hấp phụ các hợp chất dư thừa sinh ra trong quá trình trao đổi chất, làm dịu tác dụng của ABA đồng thời giữ môi trường ổn định và trong suốt.

Giai đoạn tái sinh cây con và ra rễ

Sau khi phôi Soma đã đạt độ trưởng thành sinh lý, chúng ta sẽ tiến hành bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy mô dừa in-vitro là tái sinh cây con hoàn chỉnh và hình thành bộ rễ chức năng. Đây là giai đoạn chuyển tiếp từ phôi sang cây thật khi mà các cấu trúc sơ khởi của cây đã phát triển đồng bộ tạo nên một hệ thống cơ quan hoàn chỉnh có khả năng tự dưỡng.

Vậy nên môi trường nuôi cấy mô dừa trong giai đoạn này đòi hỏi sự tinh chỉnh cao về nồng độ hormone và những điều kiện ngoại vi để đảm bảo phôi không chỉ nảy mầm mà còn phát triển ổn định, khỏe mạnh khi chuyển ra môi trường ngoài.

Môi trường nuôi cấy mô dừa được sử dụng ở đây chủ yếu là môi trường MS hoặc Y3, cân bằng giữa kích thích ra rễ và duy trì phát triển chồi, giúp cây con phát triển cân đối. Trong môi trường nuôi cấy mô dừa, Auxin giữ vai trò trung tâm với việc áp dụng IBA thay vì 2,4-D hay NAA ở nồng độ cao vì điểm mạnh chính của IBA là kích thích khả năng ra rễ hiệu quả nhưng ít gây dị dạng mô.

Ở mức vừa đủ thì IBA sẽ thúc đẩy hình thành mô rễ sơ khởi từ cực rễ của phôi và đồng thời giúp tế bào rễ kéo dài nhanh. Tuy vậy, NAA và Kinetin vẫn được bổ sung với nồng độ thấp trong môi trường nuôi cấy mô dừa, với NAA hỗ trợ hình thành mô liên kết rễ-chồi và đảm bảo sự gắn kết chắc chắn giữa hệ rễ và trục thân, còn Kinetin được thêm vào nhằm kích thích phát triển mầm chồi và lá thật.

Lưu ý rằng khi này cây con sẽ bắt đầu chuyển từ nguồn dinh dưỡng dị dưỡng sang tự dưỡng nên việc có một lượng nhỏ Cytokinin trong môi trường nuôi cấy mô dừa sẽ giúp chồi phát triển xanh đậm, gia tăng khả năng hấp thu ánh sáng.

Ở giai đoạn này, nồng độ Succrose được duy trì như giai đoạn trước, nhưng nguồn Carbon trong môi trường nuôi cấy mô dừa không chỉ là nguồn năng lượng cho cây hấp thu mà còn đóng vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu để giúp cây con duy trì sự cân bằng nước khi bắt đầu hình thành lỗ khí. Than hoạt tính tiếp tục đảm nhận vai trò hấp phụ các hợp chất phenolic tiết ra từ mô rễ non, hạn chế hóa nâu và ổn định độ trong của môi trường để cây quang hợp hiệu quả hơn.

Đọc thêm nội dung mở rộng trong bài viết kế tiếp: Trồng dừa sáp mô năng suất cao

ViGen – Đơn vị tư vấn và hỗ trợ lý tưởng trong lĩnh vực nuôi trồng và nhân giống dừa cấy mô

Như vậy, thông qua bài viết này, chúng tôi đã cùng các bạn đọc tìm hiểu về môi trường nuôi cấy mô dừa thích hợp qua từng giai đoạn phát triển của cây. Nếu các bạn cần được tư vấn và hỗ trợ nuôi trồng đối với các giống dừa, đặc biệt về dừa cấy mô, ViGen tự hào là đơn vị cung cấp cây giống cũng như hỗ trợ và tư vấn tận tình từ việc chọn giống, phương pháp chăm sóc và dưỡng cây, chúng tôi luôn đồng hành cùng khách hàng trong suốt quá trình nuôi trồng của quý khách.

Với kinh nghiệm thực tiễn và đội ngũ am hiểu tường tận trong lĩnh vực, chúng tôi cam kết mang đến những giải pháp tối ưu để giúp cho quá trình trồng và chăm sóc cây trồng của quý khách hàng được thuận lợi, tiết kiệm thời gian và đạt hiệu quả cao nhất.

Tiếp tục tìm hiểu ở phần bài viết dưới đây: Kỹ thuật nhân giống dừa sáp