Nuôi cấy chuối sáp cấy mô và khó khăn trong quy trình khử trùng mẫu

Chuối sáp là một trong số những giống chuối phổ biến hiện nay, nổi tiếng không chỉ về giá trị dinh dưỡng cao mà còn về tính dễ trồng cũng như tính đa dụng của chúng khi có thể khai thác cả quả, hoa và thân để dùng cho nhiều mục đích khác nhau. Nhờ những đặc tính này, chuối sáp vừa mang lại nguồn thực phẩm phong phú mà vừa đem đến giá trị kinh tế ổn định cho người trồng, đồng thời chúng còn đáp ứng tốt với nhu cầu tiêu thụ trong nước và mở ra tiềm năng xuất khẩu.

Ở bài viết này, ViGen sẽ cùng các bạn tìm hiểu về quy trình để thực hiện xử lý chuối sáp được nhân giống từ một trong những phương pháp hiện đại và tiềm năng hiện nay: chuối sáp cấy mô.

Môi trường nuôi cấy chuối sáp cấy mô

Chủ yếu khi nuôi cấy chuối sáp cấy mô, người ta ưa chuộng sử dụng môi trường MS ( Murashige & Skoog ) được bổ sung thêm 30g đường succrose và 8g agar hoặc 3g gelrite với mỗi lít môi trường pha chế. Lưu ý rằng độ pH của môi trường phải được điều chỉnh về mức 5.7-5.8 trước khi tiến hành hấp khử trùng.

Ở những giai đoạn sinh trưởng khác nhau, yêu cầu về thành phần của môi trường nuôi cấy cũng sẽ có những sự căn chỉnh nhất định. Đối với giai đoạn tạo chồi, sự bổ sung của các Cytokinin là phải có để co sự khởi phát và nhân nhanh số lượng chồi in vitro.

Phổ biến nhất tại đây thì sẽ là BAP hoặc TDZ, ngoài ra thì một lượng nhỏ Auxin như IAA cũng có thể được thêm vào với tỷ lệ 1/10 so với Cytokinin để đảm bảo sự cân bằng sinh trưởng, giúp chồi phát triển khỏe, hạn chế dị dạng và đồng thời hỗ trợ quá trình khởi tạo rễ trong giai đoạn tiếp theo.

Ở một số nghiên cứu cũng chỉ ra, việc áp dụng công thức môi trường gồm MS và 3-5 mg/L BAP sẽ cho tỷ lệ tái sinh cao, đồng thời thì nếu thêm 1 lượng nhỏ TDZ còn cho hiệu quả cao hơn, nhưng sẽ gây dị dạng nếu cho quá nhiều.

Ở giai đoạn tạo rễ, thành phần môi trường lại yêu cầu cao hơn về nồng độ Auxin, thường sẽ dao động từ 0.5-2.0 mg/L IAA hoặc 0.1-0.5 mg/L NAA, một số báo cáo đã sử dụng NAA với nồng độ vào khoảng 0.5 mg/L cho ra kết quả tốt cho chuối sáp. Ngoài các thành phần chính, môi trường nuôi chuối sáp cấy mô thường được bổ sung thêm một số chất hữu ích nhằm nâng cao hiệu quả nhân giống. Cụ thể như các loại vitamin như thiamine và pyridoxine cùng với myo-inositol có vai trò hỗ trợ quá trình sinh trưởng tế bào.

Trong trường hợp mô bị oxy hóa mạnh, có thể bổ sung ascorbic acid ở nồng độ 50–100 mg/L để hạn chế hiện tượng hóa nâu. Bên cạnh đó, việc sử dụng PPM (Plant Preservative Mixture) với nồng độ 0,1–0,2 mL/L ngay từ giai đoạn đầu cũng giúp kiểm soát tình trạng nhiễm khuẩn nội sinh và ngoại sinh, góp phần đảm bảo tính sạch của mẫu nuôi cấy.

Đánh giá hiệu suất khử trùng của các hóa chất đối với quy trình khử trùng chuối sáp cấy mô

• Natri hypoclorit (NaOCl) ở nồng độ 1–2% được xem là tác nhân phổ biến nhất với khả năng oxy hóa mạnh cùng khả năng tiêu diệt phần lớn vi khuẩn và nấm bám ngoài bề mặt. Tuy nhiên, khi dùng thời gian xử lý quá lâu sẽ dễ gây cháy mô và làm giảm sức sống của mẫu. Khi kết hợp với chất hoạt động bề mặt như Tween 20, hiệu quả tiếp xúc được cải thiện rõ rệt.
• Ethanol 70% là chất diệt khuẩn nhanh, thường dùng để nhúng mẫu trong thời gian ngắn (20–30 giây). Ưu điểm của Ethanol là khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật tức thì, nhưng nếu ngâm quá lâu sẽ làm mất nước và hư hại mô.
• Thuốc trừ nấm (Carbendazim hoặc Bavistin 0,1–0,2%) có tác dụng hạn chế nấm mốc ngay từ giai đoạn xử lý sơ bộ ở bề mặt và đặc biệt hữu ích với các mẫu lấy từ đất dễ bị nhiễm. Tuy nhiên, chúng chỉ có tác dụng tốt đối với nấm ngoài bề mặt, còn nấm nội sinh và vi sinh thì không có tác dụng.
• Thủy ngân clorua (HgCl₂, 0,1%) sở hữu hiệu quả khử trùng cực cao và tác động mạnh lên cả vi khuẩn lẫn nấm. Tuy nhiên, hóa chất này cực kỳ độc hại và dễ để lại dư lượng khó xử lý sau khi thao tác, vì vậy hiện nay ít được khuyến nghị trong các phòng thí nghiệm hiện đại.
• Plant Preservative Mixture (PPM) ở nồng độ 0,1–0,2 mL/L được bổ sung trực tiếp vào môi trường nuôi cấy để hạn chế nguy cơ bị nhiễm nội sinh kéo dài trong giai đoạn đầu. Tuy PPM ít gây độc cho mô và hoạt động thực sự hiệu quả, nhưng chi phí để sử dụng khá cao nên thường PPM chỉ được sử dụng ở những thí nghiệm yêu cầu tỷ lệ sạch tối ưu.

Quy trình khử trùng mẫu tối ưu cho chuối sáp cấy mô

Trong quá trình xử lý mẫu chuối cấy mô, do đặc điểm của chuối sáp, bộ phận chồi non và chóp sinh trưởng của cây thường chứa nhiều vi sinh vật nội sinh, cộng thêm bề mặt ngoài dễ bám bụi đất và tàn dư hữu cơ, việc khử trùng trở nên khó khăn hơn so với nhiều loài cây khác. Trong giai đoạn xử lý sơ bộ bên ngoài, rửa sạch mẫu bằng nước máy chảy kết hợp chất tẩy rửa nhẹ sẽ giúp loại bỏ tạp chất cơ học. Tiếp đó, việc ngâm trong dung dịch thuốc trừ nấm như Carbendazim có tác dụng giảm tải nấm mốc trước khi đưa vào điều kiện vô trùng.

Sau đó, trong khâu khử trùng mẫu trong tủ cấy, bắt đầu bằng việc mẫu được ngâm nhanh trong dung dịch Tween 20 để làm ướt bề mặt, giúp dung dịch khử trùng thấm đều và tăng hiệu quả diệt khuẩn. Tiếp đó, xử lý mẫu bằng NaOCl 1–2% có tác dụng oxy hóa mạnh trong 10–15 phút , sau đó mẫu sẽ được nhúng nhanh qua ethanol 70% trong 20–30 giây.

Cuối cùng, mẫu phải được rửa sạch bằng nước cất vô trùng ít nhất 3–5 lần nhằm loại bỏ toàn bộ hóa chất tồn dư, tránh gây cháy mô khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Ở một số mẫu già và khó xử lý, HgCl₂ cũng sẽ được áp dụng vào quy trình trong khoảng thời gian từ 5-8 phút vì hiệu quả rất cao, nhưng thường thì quy trình chuẩn sẽ không khuyến nghị vì hóa chất này khá độc hại.

Một số đề xuất nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm dành cho chuối sáp cấy mô

Vậy thì, ngoài việc thực hiện những quy trình khử trùng nhằm loại bỏ tỷ lệ gây nhiễm cho mẫu cấy của chuối sáp cấy mô, việc tuân thủ thực hiện một số thao tác nhất định cũng sẽ góp phần giảm thiểu tỷ lệ này. Chúng tôi sẽ đưa ra một số đề xuất dựa trên mức độ và quy mô thực hiện.

Biện pháp nguồn (trước khi thu mẫu)

Khi chọn mẫu để cấy thì nên chọn cây mẹ khỏe, không sâu bệnh. Thu mẫu từ cây đã được chăm sóc sạch sẽ, phun thuốc nấm hệ thống vài ngày trước (ví dụ Carbendazim) nếu an toàn.
Cắt bỏ các lá và vỏ ngoài dơ trước khi vận chuyển vào phòng vô trùng.

Giữ explant trong dung dịch vận chuyển khử khuẩn nhẹ, ví dụ như dung dịch gồm nước và PPM 0.1% hoặc nước và 50–100 mg/L ascorbic acid trong quá trình vận chuyển mẫu vào khử trùng.

Thực hiện quy trình khử khuẩn tiêu chuẩn

Thực hiện đúng quy trình khử khuẩn tiêu chuẩn là điều kiện tiên quyết để giảm thiểu nguy cơ nhiễm trong nuôi chuối sáp cấy mô. Khi các bước được tuân thủ nghiêm ngặt, vi sinh vật gây hại sẽ được loại bỏ hiệu quả nhưng đồng thời mô cấy vẫn giữ được khả năng sống sót và phát triển tốt. Nhờ đó, tỷ lệ mẫu sạch được nâng cao, giảm thiểu được thất thoát và đảm bảo quá trình nhân giống đạt hiệu quả ổn định.

Các yếu tố xử lý nội sinh

Đối với các trường hợp nhiễm nội sinh khó loại bỏ bằng quy trình khử trùng bề mặt thông thường thì việc nuôi chồi đỉnh là một giải pháp hiệu quả. Bằng cách sử dụng những mô cực nhỏ từ 0,3–0,5 mm là nơi phần lớn các mô chứa vi sinh vật bị loại bỏ trong khi phần meristem vốn ít bị nhiễm hơn sẽ được duy trì, từ đó giúp gia tăng khả năng tái sinh mẫu sạch bệnh.

Như đã nói ở trên, PPM mang lại hiệu quả kiểm soát nhiễm rất đáng kể. PPM có thể được dùng để ngâm mẫu trước khi cấy từ 1–2 giờ ở nồng độ 0,05–0,1% hoặc bổ sung trực tiếp vào môi trường khoảng 0,1–0,2 mL/L. Tuy nhiên, PPM chỉ có thể đóng vai trò hỗ trợ, còn vai trò khử trùng chính thì PPM không thể thay thế hoàn toàn.

Kháng sinh môi trường như cefotaxime (200–500 mg/L), streptomycin (50–100 mg/L) hay rifampicin có thể được bổ sung trong trường hợp phát hiện vi khuẩn. Dù vậy, biện pháp này cần phải được sử dụng cẩn thận vì kháng sinh có thể gây độc cho mô và làm mẫu bị lệ thuộc vào thuốc. Do đó, việc sử dụng kháng sinh chỉ nên tiến hành khi đã xác định rõ tác nhân gây nhiễm.

Thực hiện cấy chuyền sớm có thể được tiến hành nếu quan sát thấy nhiễm nhẹ ở một số ống, cần nhanh chóng tách chồi sạch sang bình mới để tránh lây lan ra toàn bộ lô nuôi cấy. Với mục đích nghiên cứu, người ta có thể kết hợp sàng lọc bằng PCR hoặc nuôi cấy chủng vi sinh để xác định chính xác tác nhân gây nhiễm, từ đó có thể đưa ra lựa chọn phương pháp xử lý thích hợp và lâu dài.

Vệ sinh môi trường & thao tác

Một số thao tác vệ sinh ở môi trường nuôi cấy cũng sẽ góp phần làm giảm thiểu rủi ro làm nhiễm mẫu cấy. Trước khi làm việc trong tủ cấy thì cần phải vệ sinh bề mặt bằng cồn 70 độ và sau khi thao tác cũng cần thực hiện. Đối với các dụng cụ kim loại thì cần đốt qua để khử trùng trước khi thao tác cho từng bước, và chúng ta cần hạn chế sử dụng liên tục qua nhiều bước mà không thực hiện khử trùng.

Trong quá trình nuôi chuối sáp cấy mô, cần quy định số lượng mẫu trong mỗi mẻ cấy ở mức hợp lý để dễ dàng quản lý, theo dõi và hạn chế nguy cơ chéo nhiễm giữa các mẫu. Bên cạnh đó, tuyệt đối không nên lưu trữ mẫu trong điều kiện không vô trùng trước khi đưa vào môi trường, bởi chỉ cần thời gian ngắn trong môi trường thường cũng đủ để vi sinh vật phát triển, làm tăng nguy cơ nhiễm và giảm tỷ lệ mẫu sạch.

ViGen – Người bạn đồng hành lý tưởng trong lĩnh vực nuôi trồng

Thông qua bài viết này, chúng tôi đã cùng các bạn đọc tìm hiểu về quy trình nuôi cấy cũng như tìm hiểu kỹ về các yếu tố khử trùng đối với quy trình xử lý mẫu giống chuối sáp cấy mô. ViGen tự hào là đơn vị cung cấp cây giống cũng như hỗ trợ và tư vấn tận tình từ việc chọn giống, phương pháp chăm sóc và dưỡng cây, chúng tôi luôn đồng hành cùng khách hàng trong suốt quá trình nuôi trồng của quý khách.

Với kinh nghiệm thực tiễn và đội ngũ am hiểu tường tận trong lĩnh vực, chúng tôi cam kết mang đến những giải pháp tối ưu để giúp cho quá trình trồng và chăm sóc cây trồng của quý khách hàng được thuận lợi, tiết kiệm thời gian và đạt hiệu quả cao nhất.

Xem ngay: Chuối bàn tay Phật từ văn hóa, dinh dưỡng đến ứng dụng và công nghệ cấy mô hiện đại